数字时代:模型工具助力抗体连续过程开发

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近日，Biotechnology and Bioengineering期刊连续发表了题为 “Process development and optimization of continuous capture with three-column periodic counter-current chromatography”[1]和“Analysis and optimal design of batch and two-column continuous chromatographic frontal processes for monoclonal antibody purification”[2]的两篇论文。第一作者为史策，来自浙江大学化学工程与生物工程学院林东强教授课题组。论文的英文全文可通过如下链接获得:

https://doi.org/10.1002/bit.27689

https://doi.org/10.1002/bit.27763

1. 研究背景
单克隆抗体是最重要的生物技术药物，近年来发展迅速，市场竞争激烈，带来了新的机遇和挑战。传统的批次生产方式投资大，风险高，能耗、物耗和废液量大，难以适应未来产业的发展需要。改变传统工艺，实现连续化生物制造，是国际产业发展的趋势，可以提高产品质量和过程效率，促进设备和车间小型化，减少废物排放，降低生产成本。目前上游的灌流培养（或连续流）技术已经得到突破，连续生物制造的关键难点在于下游分离过程，尤其是层析。由于连续流层析模式复杂，参数较多，相互交联，过程优化难度大。针对连续流层析的复杂性和特殊性，浙江大学林东强教授课题组引入机理模型，构建模型辅助的连续流层析过程设计新方法，提高过程开发效率，促进新技术的推广和应用。

以下将针对抗体捕获和精制过程的连续流层析技术，分别介绍模型辅助的连续流层析过程设计新方法。

2.  连续抗体捕获
对于抗体捕获，蛋白A亲和层析是行业“金标准”，但传统的单柱批次层析技术存在局限性。常规层析通常采取低穿透点终止上样，如图1a，此时介质利用率较低，一般为50~60%，这对于昂贵的蛋白A亲和介质，是极大的损失。为提高介质利用率，将单柱批次处理方式转变为多柱串联的连续上样模式，前柱穿透的蛋白被后柱所捕获，从而可以在较高的穿透点终止上样，如图1b，显著提高介质利用率。同时通过多柱交替切换，实现连续蛋白捕获，提高过程工艺效率。基于上述原理，已推出不同操作模式的连续流层析系统，包括双柱连续流层析CaptureSMB（ChromaCon公司）、三柱/四柱3C-PCC和4C-PCC（Cytiva公司）、3-16柱BioSMB（Sartorius公司）以及4-8柱SMCC（Novasep公司）。



图1. 连续捕获层析中双柱串联上样增加介质利用率

两柱CaptureSMB和三柱3C-PCC连续流层析的具体过程见图2。不同模式各有优缺点，存在不同的限制因素，综合比较需要系统评估。此外，连续流层析的操作参数和影响因素显著增多，且参数之间存在交互作用，增加了过程优化的难度，常规的实验优化手段往往难以达到目的。利用层析模型进行预测分析，可以系统评价关键参数对连续捕获的影响，有助于连续流层析过程的理性设计。



图2. CaptureSMB和3C-PCC过程示意图[3]

针对抗体亲和捕获，林东强教授课题组构建了层析机理模型，对不同操作条件下的穿透曲线进行表征和预测，并结合连续流层析的过程模型，构建过程设计和性能指标评价方法，系统分析不同操作参数对过程产率和介质利用率的交互影响，从而实现过程工艺优化。结果表明，过程产率随关键操作参数变化趋势复杂，呈现阶段性的变化特征，且不同连续捕获模式表现出不同规律，需要不同的优化策略[4-6]。经模型辅助优化，MabSelect SuRe介质的CaputreSMB最大过程产率达33.3 g/L/h，介质利用率为94.3%[4]；MabSelect SuRe LX介质的3C-PCC最大过程产率达34.5 g/L/h，介质利用率为97.6%，较传统的批次层析得到了大幅度提高[1]。在此基础上，进一步提出了模型辅助连续流层析过程优化的基本策略，并在不同案例中得到应用，有助于单抗类药物连续捕获的工艺开发。



图3. 3C-PCC模型辅助过程设计示意图[1]

3.  连续精制层析
在抗体下游分离中，精制层析包括吸附-洗脱模式和流穿模式。对于流穿模式，迎头层析可以利用料液中自身组分进行置换，通过强吸附组分推动弱吸附组分移动，实现有效分离。迎头层析具有处理量大的优势，但其本身存在一定的局限性。常规单柱批次操作模式，在上样和冲洗过程中杂质容易流穿至产品池中，影响产品纯度，存在纯度、收率和过程产率三者之间的相互制约关系（trade-off）。新型的双柱连续迎头层析模式Flow2，采用双柱串联上样、连接清洗以及在线稀释，降低杂质流穿风险，提高了目标组分收率，较单柱迎头层析具有更好的过程表现和操作空间。图4为单柱迎头层析和Flow2过程比较示意图。



图4. 单柱迎头层析和Flow2过程示意图[2]

由于迎头层析相比于亲和层析过程参数更多，过程工艺优化更为复杂。林东强教授课题组与意大利米兰理工大学Morbidelli教授课题组合作，针对双柱连续迎头层析Flow2开展过程建模和优化研究，以单抗单体和聚集体分离为目标，在设定纯度要求下，改善过程产率和收率之间的相互制约关系。结合集总动力学模型、DLVO理论和Flow2过程模型，建立了基于过程认知的Design Procedure方法，对Flow2过程性能进行合理表征，实现多参数和多目标优化。结果表明，Flow2相比于单柱迎头层析具有明显优势，在较低上样流速下过程产率为单柱迎头层析的3倍；Flow2可在较高盐浓度下实现更高的过程产率和收率，当收率为99%时，Flow2过程产率可以达到130 g/L/h以上，较单柱迎头层析提高36.5%[2]。参数敏感性分析表明，Flow2过程鲁棒性更高。



图5. Flow2模型辅助过程设计示意图[2]

4.  结语
对于复杂的连续流层析，常规的实验优化方法存在以下局限性：（1）连续流层析一般需要运行3个循环以上到达稳态，比批次工艺耗费时间更长，物料消耗量大；（2）过程复杂，参数众多，若要对多个因素进行交互影响分析，需要进行大量实验优化；（3）通过实验仅仅能得到离散的几个“实验点”的结果，无法得到完整的变化规律，难以实现总体性的优化。采用模型工具，可以通过有限的实验数据拟合得到模型参数，从而获得任意条件下的连续流层析性能，系统分析不同操作参数影响，实现关键工艺操作参数的优化，提高过程效率，节省大量人力和物力，促进连续流层析的理性设计。图6是模型辅助连续流层析过程开发示意图。



图6. 模型辅助连续流层析过程开发示意图[3]

为了方便模型辅助方法的使用和推广，林东强教授课题组开发了连续流层析过程设计集成软件包PSCC，该软件已在国内多家生物制药公司得到应用，并取得了良好效果，示意图见图7。



图7. 集成软件辅助连续流层析过程开发

连续化、数字化、智能化是生物制药的发展趋势，其中数字化是关键的中间纽带，既是连续化生产稳定运行的重要保障，也是智能化制造的前提条件。引入机理模型，加强过程的系统认知；结合人工智能，提高复杂问题的解决能力，将有力促进抗体药物连续工艺的工业化实现。

作者简介
史策，浙江大学博士研究生。具备生物分离、过程模拟和优化、人工智能应用等基础和技能。目前基于课题组研究方向，主要开展连续流层析过程建模、生物制造过程模型以及人工智能应用等研究。



林东强，浙江大学教授，主要从事生物分离工程、生物制药工程和生物过程工程研究。近期研究重点为连续生物制造、计算机辅助过程设计，以及工业4.0和数字孪生新技术及其应用。个人网页：https://person.zju.edu.cn/0098032



参考文献
1.  Ce Shi, Qi-Lei Zhang, Biao Jiao, Xu-Jun Chen, Ran Chen, Wei Gong, Shan-Jing Yao, Dong-Qiang Lin. Process development and optimization of continuous capture with three-column periodic counter-current chromatography. Biotechnol. Bioeng.,2021. https://doi.org/10.1002/bit.27689

2.  Ce Shi, Sebastian Vogg, Dong-Qiang Lin, Mattia Sponchioni, Massimo Morbidelli. Analysis and optimal design of batch and two-column continuous chromatographic frontal processes for monoclonal antibody purification. Biotechnol. Bioeng., 2021. https://doi.org/10.1002/bit.27763

3.  Dong-Qiang Lin, Qi-Lei Zhang, Shan-Jing Yao. Model-assisted approaches for continuous chromatography: current situation and challenges. J. Chromatogr. A, 1637:461855, 2021. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2020.461855

4. Ce Shi, Zong-Ye Gao, Qi-Lei Zhang, Shan-Jing Yao, Nigel K.H. Slater, Dong-Qiang Lin. Model-based process development of continuous chromatography for antibody capture: a case study with twin-column system. J. Chromatogr. A, 1619: 460936,2020. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2020.460936

5. Yan-Na Sun, Ce Shi, Qi-Lei Zhang, Shan-Jing Yao, Nigel K.H. Slater, Dong-Qiang Lin. Model-based process development and evaluation of twin-column continuous capture processes with Protein A affinity resin. J. Chromatogr. A, 1625:461300, 2020. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2020.461300

6.   荆淑莹，史策，姚善泾，林东强. 连续流层析及用于抗体分离的新进展. 高校化学工程学报，35(1):1-12，2021. https://doi.org/10.3969/j.issn.1003-9015.2021.01.001

中文作者 | 史策 林东强

中文审阅 | 王守业 陶维红

编辑 | 商建宇



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